Alkoholna fermentacija z inokulacijo mešanih starterskih kultur z ne-Saccharomyces kvasovkami je dokaj nezanesljiva in tvegana v smislu zaustavljenih AF in tvorbe negativnih aromatičnih spojin, ter zahteva za uspešno izvedbo precej znanja o mikrobioloških procesih med alkoholno fermentacijo.

Ravno zato v praksi pogosteje uporabljamo inokulacijo mošta s tržnimi sevi kvasovk S. cerevisiae in S. bayanus z znanimi fermentacijskimi lastnostmi in kinetiko. Na tržišču je ogromno različnih sevov kvasovk rodu Saccharomyces in številne raziskave so pokazale, da različne vrste tržnih sevov zelo različno vplivajo na senzorično kakovost vina, saj imajo različno sposobnost sinteze, sproščanja in pretvarjanja aromatičnih spojin med alkoholno fermentacijo.

Nekatere imajo močno ß-glukozidazno aktivnost in sprostijo večje koncentracije terpenov, druge imajo močno ß-liazno in alkohol acetiltransferazno aktivnost in sprostijo večje koncentracije aromatičnih hlapnih tiolov, spet druge tvorijo večje vsebnosti višjih alkoholov in estrov ter izboljšajo sadni karakter vina. Na tržišču je cel nabor različnih sevov Saccharomyces kvasovk z različnimi lastnostmi.

V članku bomo predstavili 4 faze za pravilno rehidracijo kvasovk oz. pravilno pripravo kvasnega nastavka.

Zavedati se moramo, da so rastne razmere kvasovk med alkoholno fermentacijo mošta in industrijsko produkcijo starterskih kultur popolnoma različni (preglednica 5); razlikujejo se tako v kemijskih, bioloških in fizikalnih parametrih, kakor tudi v metabolni aktivnosti kvasovk in želenih končnih produktih.

Prvi stres za kvasovke predstavljata rehidracija in inokulacija starterske kulture, ki sta povezani s hiperosmotskim šokom. Po adaptaciji celic na novo okolje (mošt) sledijo stresne razmere, vezane na samo fermentacijo. Med te stresne dejavnike prištevamo:

Omejeno količino in nazadnje pomanjkanje hranilnih snovi (vir dušika);

Neravnotežje med ogljikovimi hidrati (glukozo in fruktozo) ter dušikom;

Pomanjkanje molekularnega kisika, ki je nujno potreben za sintezo nenasičenih maščobnih kislin in ergosterola v membrani; 

Toksičnost etanola: biološki vpliv etanola na celično rast in učinkovitost fermentacije je posledica sprememb v lastnostih celične membrane (prepustnosti in tekočnosti), ki se lahko začnejo že pri relativno majhni koncentraciji etanola 2–4 vol.%;

Toksičnost maščobnih kislin (C6, C8 in C10): že v koncentraciji nekaj mg/L vplivajo na prepustnost (permeabilnost) celične membrane, ki se odraža v zaustavitvi fermentacije (encimski sistemi kvasovk še funkcionirajo, medtem ko sladkor ne prehaja (penetrira) v celico in se ne metabolizira);

Temperatura: vinske kvasovke so občutljive na temperaturne spremembe proti koncu fermentacije, ko je več tudi alkohola. V tej fazi je lahko usodno že povečanje temperature za 2–3 C.

Med manj pomembne, nikakor pa nezanemarljive ostale stresne dejavnike med fermentacijo prištevamo še: SO₂ (na začetku), CO₂ (v penečih vinih), prisotnost kompetitivnih organizmov in prisotnost toksinov, ki jih ti organizmi (plesni in bakterije) lahko tvorijo.

Omenjeni dejavniki niso neposredno vezani na samo fermentacijo, temveč moramo vzrok iskati v postopkih predelave grozdja in obdelave mošta, vključno s samimi razmerami v kleti (higiena).

 Se Vam je ustavilo vrenje? Preberite naš članek kaj storiti v primeru zaustavitve alkoholne fermentacije!

INOKULACIJA STARTERSKIH KULTUR

Kako pripraviti zdravo startersko kulturo?

V inokulumu mora biti vsaj 2–5 milijonov aktivnih kvasnih celic v 1 mL (to odgovarja 1–3 vol.% inokuluma - slediti moramo navodilom proizvajalca za rehidracijo kvasovk.

Odvisno od mošta je potreben dodatek 15 – 40 g/hL suhih kvasovk. Doziranje je zmeraj napisano na embalaži proizvajalca - za bela in rdeča vina, ter za ustavljeno vrenje.

V primeru slabšega zdravstvenega stanja grozdja (gniloba) potrebujemo večji inokulum med 20–40 g/hL; v belih moštih iz zdravega grozdja in opravljenem bistrenju je običajni dodatek inokuluma med 15–25 g/hL.

1. Preprečitev temperaturnega šoka - faza rehidracije

Temperatura rehidracijske vode = 35 – 40 ºC oz. 43 ºC pri dodajanu hranil za zaščito kvasovk.

Ne uporabljamo klorirane vode.

V prvi fazi rehidracije ne dodajamo v vodo niti sladkorja niti mošta (osmotski stres povzroči le manjšo živost kvasne populacije).

2. Zagotovitev potrebnih hranil

Kvasovke v vinu in moštu čakajo številne nezaželene spojine in divja mirko flora, velikokrat pa se znajdejo tudi v zelo neugodnih razmerah. Dodana hranila (hrana za zaščito kvasovk GOFERM PROTECT EVOLUTION, ki je najbolj specializiran tovrstni proizvod) v vodi za rehidracijo, PRED dodajanjem kvasovk obogatijo kvasovke s steroli in na ta način okrepijo membrano. Hranilo v katerem so inaktivne kvasovke obogatene z mikro elementi in vitamini imajo še dodaten učinek - na ta način dodamo našim kvasovkam v optimalni količini prav tisto kar potrebujejo v ostrih pogojih v katerih se znajdejo v moštu.

POMEMBNO: Če pred dodajanjem kvasovk ne uporabimo hrane za zaščito kvasovk, se temperature vode prične pri 40 ºC. 

3. Dodajanje suhih vinskih kvasovk

Ko se temperatura vode obogatene s hranilom spusti do 40 ºC previdno primešamo suhe vinske kvasovke ( 25 g/hl). Premešamo in pustimo nabrekati 20–30 minut ter ponovno premešamo. Populacije sojev suhih vinskih kvasovk začnejo upadati kadar mirujejo več kot 30 minut. 

OPOZORILO: Pena ni pokazatelj vitalnosti vinskih kvasovk.

Med “stresne” parametre, ki zahtevajo specifično adaptacijo za zagotovitev celične rasti in preživetja, prištevamo:

Pomanjkanje kisika preprečimo z nepretiranim žveplanjem oziroma pomanjkanje dušika z ustreznim dodatkom;

Najmanjša vsebnost FAN = 140 mg N/L (idealno okrog 400 mg N/L); Dodatek kompleksnega hranila v rehidracijsko vodo;

Dodatek DAP do 1 g/hL (z največjo dovoljeno količino zagotovimo 258 mg N/L);

Dodatek drugih potrebnih hranil v prvi polovici alkoholne fermentacije; bolj priporočljiv je dvakratni zaporedni dodatek manjših količin v prvi tretjini AF; OBVEZNO PRED 1/2 FERMENTACIJE!

V primeru pomanjkanja kisika je proti koncu eksponentne faze rasti kvasovk in v stacionarni fazi zmanjšana sinteza lipidov in sterolov (ergosterol, zimosterol); Zato je potrebno aerobno namnoževanje kvasovk, ki vodi v značilno večji delež nenasičenih maščobnih kislin in do trikrat večjo količino sterolov, kar pozitivno prispeva k večji preživelosti in fermentacijski aktivnosti; Brez začetnega kisika je razmnoževanje kvasovk omejeno le na 4 do 5 generacij (zavedati se je treba, da tudi CO₂, dušik in askorbinska kislina zmanjšajo vsebnost molekularnega kisika);

Pri uporabi SO₂ več kot 50 mg/L v predfermentativni fazi je inaktiviran tiamin, zato je potreben ekstra dodatek tega vitamina.

Poleg omenjene preprečitve temperaturnega šoka in zagotovitve potrebnih hranil je v praksi pogosto potrebno upoštevati tudi dodatne zahteve oziroma priporočila.

4. Dodajanje mošta

Nato počasi v časovnem intervalu 5 minut dolivamo enako količino mošta, da fermentira s kvasnim nastavkom, kar kvasovkam pomaga pri prilagoditvi na hladno temperaturo mošta in pomaga pri izogibu hladnega šoka, kot posledico hitrega padca temperature, ki presega 10 ºC. Pri moštih z zelo nizko temperaturo je postopek potrebno večkrat ponoviti, pri čemer naj vsak korak prilagajanja na temperaturo traja med 15 in 20 minut. Za vsako razliko med moštom in kvasnim nastavkom, ki presega 10 ºC, je potreben korak prilagoditve temperature. Za primer; če je temperatura mošta 20 ºC in temperatura kvasnega nastavka 40 ºC, sta potrebna dva koraka prilagoditve temperature s 15-20 minutnim intervalom.

5. Dodajanje kvasnega nastavka v fermentacijsko posodo.

Kvasni nastavek dodamo na dno fermentacijske posode ob istem času, ko začnemo polniti posodo z moštom. To je še posebej pomembno pri večjih cisternah z dolgim časom polnitve ali kadar inokuliramo s sevi, ki so občutljivi na konkurenčni faktor. Prav to bo kvasovkam omogočilo hiter začetek delovanja pred avtohtonimi organizmi v moštu.

Dodatne zahteve oziroma priporočila:

1. Mošti s pH pod 3,1 potrebujejo večji inokulum kvasovk;


2. Predbistrenje ali razsluzenje moštov: do največ 0,5 % suspendiranih delcev;


3. Mešanje vsebine fermentirajočega mošta (predvsem v večjih tankih) zaradi možnosti prezgodnjega odmrtja in avtolize kvasovk na dnu;


4. Toksičnost CO2 nad 0,2 atm (z mešanjem preprečimo prenasičenje);


5. Toksičnost etanola: zaradi poškodb integritete celične membrane je najprej upočasnjen in nato prekinjen transport dušikovih spojin in sladkorja v celico. To je združeno s številnimi dejavniki (sinergizem): pH, visoka temperatura, ocetna kislina, kratkoverižne maščobne kisline, pomanjkanje dušikovih spojin, sterolov in vitaminov;


6. Prisotnost kompetitivnih mikroorganizmov (divjih kvasovk in bakterij), okuženo grozdje, slaba higiena, dolgo bistrenje in kasnejša inokulacija vodijo k zmanjšanju hranil in potencialni tvorbi toksinov (potreben je tako dodatek večjega inokuluma za prevlado kvasovk, kot dodatek hranil = 250–500 mg N/L); Ocetnokislinske bakterije zlahka tvorijo ocetne kisline več kot 0,8 g/L, kar vodi zanesljivo v zaustavitev AF;


7. Pri nizkih fermentacijskih temperaturah povečamo inokulum, oziroma ga zmanjšamo pri nekontroliranih višjih temperaturah; bolje je izbrati sev počasno fermentirajočih kvasovk;


8. Upočasnitev AF je povezana tudi s prevelikim ostankom fruktoze; Dodatek celičnih sten (yeast hulls) okrog 0,2 g/hL stimulira fermentacijo in pospeši sproščanje CO2, vendar ni ta vpliv v povezavi z razstrupljanjem (detoksifikacijo), temveč v povezavi z dodatkom nenasičenih maščobnih kislin (C16–C18), kot nadomestilom za kisik, ter preprečevanju pomanjkanja hranil (aminokislin);


9. Prisotnost preostalih pesticidov vpliva na AF ob tvorbi stresnih metabolitov, t.j. reduktivnih spojin; na zmanjšanje kontaktnih pesticidov vpliva dodatek bentonita v fazi bistrenja belih moštov; zlasti pozna uporaba bakrovih pripravkov tik pred trgatvijo značilno vpliva na povečano tvorbo vodikovega sulfida (H2S) in merkaptanov.